梅艳芳有癌症家族史，大哥梅启明2016年患上过大肠癌，而三姐梅爱芳2000年因子宫颈癌病逝、二哥梅德明在2015年因喉癌病逝。
2003年，严重急性呼吸道症候群（SARS）在香港爆发，梅艳芳为SARS病患者筹款，并发起《1：99音乐会》，号召全香港歌手演出，并成立“茁壮行动”基金会，协助受害家庭的孤雏，这场活动期间她曾向记者表示演唱会后可能“会生场大病”，但类似调侃，并没有引起注意。到7、8月间，外界盛传她罹患癌症，其后她在2003年9月向外宣布证实罹患子宫颈癌，起初采取保守治疗，但是中医治疗效果不佳，之后才接受化疗及电疗。事实上，梅艳芳病逝两年多前就已诊断出罹患子宫颈癌，那时只属零期阶段，若接受局部组织切除，治愈率几近百分之百，但她以希望生儿育女及工作繁忙为由拒绝就医切除子宫，以致病情恶化，直至痛极难耐时才肯勉强求医。她在亲友以及徒弟的陪同下坚定地说：“这场仗我一定打赢！”并承诺奋勇对抗病魔，后在健康状况恶化的情况下，仍坚持抱病举行演唱会，并在演唱会穿上刘培基设计的婚纱，完成了“嫁给舞台”的心愿。演唱会后，梅艳芳仍到日本拍摄美容广告，及后在朋友和医生极力劝喻下辞演张艺谋执导的电影《十面埋伏》。
2003年12月初，卧病的梅艳芳就已私下订立遗嘱，却始终没有放弃继续登台演出的希望。据其挚友、著名文学家李碧华在《花开有时，梦醒有时》一文中回忆，梅艳芳曾在病榻上看到她传真的舞台剧剧本讯息，却因医生告知“癌细胞扩散，今后再不能登台演出”而抛下一句“既是这样，我便走了”。12月26日，梅艳芳陷入半昏迷，医生为她打吗啡针止痛，29日晚上进入弥留状态，所有好友均赶到医院探望。12月30日凌晨2时50分，梅艳芳终因癌细胞扩散导致肺功能衰竭，于养和医院逝世，享年40岁；生前众多好友，在病榻前陪伴她到最后一刻，好友都说梅艳芳去得很安详，离开时样子还很甜美，虽然很累。她在最后一次演唱会上曾说，遗憾自己没有结婚，无儿无女。她离世的时候，各方亲友和生前的男友，纷纷赶往医院，陪她走完最后一程。梅艳芳的辞世震动全港，香港多份华文报章推出特辑及号外，而环球唱片亦在谭咏麟网页发表声明，表示梅艳芳的去世乃亚洲区的损失；时任香港特首董建华亲自到灵堂致祭。有歌迷穿上印有“Anita Mui永远怀念”字眼的黑衣在殡仪馆外守候。张艺谋为表尊重，决定不找其他演员代演她在《十面埋伏》的角色。另外，其遗作《男人四十》令她当上长春电影节的“最佳女主角”。
2004年1月12日梅艳芳于香港殡仪馆出殡，治丧委员会以《别矣，香港的女儿！》为题刊登讣闻，有上万市民参与送别，单香港艺人参加的人数就有600多人，另外还有很多外籍艺人以及大陆的艺人和香港政府各级官员。数万名影迷歌迷泪洒当场，人们都在送梅艳芳最后一程。八位扶灵人是刘德华、刘培基、梁朝伟、陶喆、连炎辉、苏孝良、张敏仪、杨紫琼，他们都是梅艳芳的生前好友。梅艳芳的姨甥和谢霆锋捧著梅艳芳的遗照送梅艳芳最后一程，她的遗照和当初张国荣的遗照一样，手中的香烟都被去掉，只剩下了一个手势去纪念他们的友情。梅艳芳很珍惜与每一位朋友的关系，去世的时候还想着自己的朋友跟粉丝，她的遗言是：“别哭，别叫我名字”感动了全香港。
目前，梅艳芳在香港有两个灵位可供公众拜祭，分别位于香港大屿山天坛大佛和九龙塘省善真堂。
中国大陆歌迷在许多佛寺内为梅艳芳供奉灵位。地点包括广州，上海，北京，南京，杭州，成都，武汉， 天津，沈阳，云南，山东，江西，西安，太原，郑州等等。
